利用嵌合抗原受體 (Chimeric antigen receptor，CAR) 載體生產(chǎn)可識別腫瘤相關抗原的工程T細胞（也稱為CAR-T細胞）已成為一種極富前景的癌癥治療工具。在 CAR-T細胞免疫療法中，來自患者（自體）或健康供體（同種異體）的T細胞經(jīng)過改造表達CAR。CAR受體可以靶向識別腫瘤細胞表面抗原，活化T細胞使其發(fā)揮免疫作用以幫助殺傷腫瘤細胞。

CAR受體的結構由四個主要部分組成：（1）一個胞外抗原識別結構域，由已知特異性的抗體的單鏈可變區(qū)片段 (Single chain variable fragment，scFv) 組成。 scFv促進抗原結合，包含一個輕鏈可變區(qū)片段和一個特異的單克隆抗體的重鏈片段，兩者通過一個柔性的肽鏈相連；（2）一個位于胞外的鉸鏈區(qū)或間隔區(qū)，將scFv與CAR的跨膜結構域連接起來，并為CAR的結構提供靈活性和穩(wěn)定性；（3）跨膜結構域，將CAR錨定在質(zhì)膜上，從而將胞外的鉸鏈區(qū)和抗原結合結構域同細胞內(nèi)結構域關聯(lián)起來。它在增強受體表達和穩(wěn)定性方面起著關鍵作用；（4）胞內(nèi)信號域，通常源自T細胞受體的CD3 zeta鏈并包含免疫受體酪氨酸激活基序（Immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)?？乖Y合CAR后，ITAM被磷酸化并激活下游信號傳導，從而導致T細胞的后續(xù)活化。此外，該胞內(nèi)結構域還可以引入一個或多個與CD3 zeta信號域串聯(lián)的共刺激域（來源于CD28、CD137等），以改善T細胞增殖效率和活化的持久性。

CAR的結構在過去幾年中隨著對胞內(nèi)結構域的修改而不斷發(fā)展。第一代CAR僅包含一個衍生于CD3 zeta鏈的信號域。雖然這種CAR可以激活T細胞，但是由于表達此類CAR的T細胞的細胞毒性和增殖能力偏低，它們在體內(nèi)的抗腫瘤活性并不理想。第二代CAR除了包含一個CD3 zeta信號域，還具有一個胞內(nèi)的共刺激域，因此表達第二代CAR的T細胞顯著改善了其體內(nèi)增殖能力、擴增能力和活化的持久性。為了進一步優(yōu)化 CAR T細胞的抗腫瘤功效，第三代CAR除了CD3 zeta外，還引入了兩個胞內(nèi)順式作用的共刺激結構域。此后，通過修飾胞內(nèi)結構域以進行誘導表達或組成型表達細胞因子，第四代CAR從第二代CAR開發(fā)獲得。第五代和最新一代CAR也是從第二代CAR衍生而來，整合了細胞因子受體的胞內(nèi)結構域。

我們的CAR表達質(zhì)粒載體非常適合非病毒的第二代CAR表達盒轉(zhuǎn)染T細胞。整個CAR 表達盒包括scFv區(qū)、鉸鏈區(qū)、跨膜結構域和胞內(nèi)CD3 zeta信號域以及共刺激域，均位于用戶選擇的啟動子下游。用常規(guī)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染的一個關鍵優(yōu)勢是它是瞬時轉(zhuǎn)染的，只有非常少的質(zhì)粒會穩(wěn)定整合到細胞基因組中（通常小于1%）。

有關此載體系統(tǒng)的更多信息，請參閱以下文獻。

我們的CAR表達質(zhì)粒載體適用于第二代CAR的瞬時表達，并且經(jīng)過特殊優(yōu)化，在大腸桿菌種具有很高的拷貝數(shù)。通過質(zhì)粒上的自定義標記基因用戶可以方便地觀測轉(zhuǎn)染效果。

技術簡單：對比病毒轉(zhuǎn)導，CAR表達質(zhì)粒載體通過電轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染T細胞是一種較為簡單的技術。病毒載體的病毒包裝過程耗時且技術上具有相當挑戰(zhàn)性。

安全性：CAR表達質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染至細胞后為瞬時表達，不整合細胞基因組，因此對比逆轉(zhuǎn)錄病毒類的載體不會產(chǎn)生顯著的插入突變風險。

大裝載量：我們的載體大小可達30 kb，而載體骨架只占有3 kb，因此留有相當多的空間用于CAR表達盒的設計，比如加入啟動子、標記基因以及額外的目的基因等。

低成本：生產(chǎn)臨床級別的質(zhì)粒載體比病毒載體可以減少相當多的成本，使用CAR表達質(zhì)粒載體制備用于臨床研究的CAR T細胞具有很高的性價比。由于CAR T細胞的臨床效果根據(jù)臨床前的小鼠上的實驗效果進行預測，因此在臨床研究中也需要使用CAR T細胞進行研究。

遞送方式：CAR表達質(zhì)粒載體通過電轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染T細胞只能對低至中等數(shù)量的細胞成功遞送CAR表達盒。此外，電轉(zhuǎn)染法對T細胞有潛在的毒性，可能會減少具有功能的CAR T細胞的產(chǎn)量。因此有可能需要在體外延長細胞的培養(yǎng)時間以達到灌注的細胞數(shù)量要求，而過長時間的培養(yǎng)也會導致細胞表型的改變與T細胞長期記憶功能的減弱。

載體DNA非整合性：質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染至細胞后主要以游離體形式的DNA存在，只有很低的頻率（10²~10⁶分之一，取決于細胞類型）會整合基因組。如果載體上帶有藥篩標記或者熒光標記，基因組整合型的載體有利于長周期細胞培養(yǎng)后的細胞篩選。

Promoter: The promoter driving your CAR expression cassette is placed here.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest because it is believed to facilitate translation initiation in eukaryotes.

CD8-leader: Leader signal peptide of T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain. Directs transport and localization of the protein to the T-cell surface.

scFv: Single chain variable fragment derived from a monoclonal antibody of known specificity. Recognizes cells in an antigen-specific manner.

Hinge: Extracellular hinge region of the CAR. Connects scFv with the transmembrane region providing stability and flexibilty for efficient CAR expression and function; enhances efficiency of tumor recognition; improves expansion of CAR-T cells.

Transmembrane domain: Transmembrane domain of the CAR. Anchors the CAR to the plasma membrane and bridges the extracellular hinge as well as antigen recognition domains with the intracellular signaling region; enhances receptor expression and stability.

Costimulatory domain: Intracellular costimulatory domain of the CAR. Improves overall survival, proliferation, and persistence of activated CAR-T cells.

CD3zeta: Intracellular domain of the T cell receptor-CD3ζ chain. Acts as a stimulatory molecule for activating T cell-mediated immune response.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream CAR expression cassette.

CMV promoter: Human cytomegalovirus immediate early promoter. It drives the ubiquitous expression of the downstream marker gene.

Marker: A drug selection gene (such as neomycin resistance), a visually detectable gene (such as EGFP), or a dual-reporter gene (such as EGFP/Neo). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.

BGH pA: Bovine growth hormone polyadenylation. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.